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shRNA 干擾實(shí)驗(yàn),你目前在哪一步?
點(diǎn)擊次數(shù):10150 更新時(shí)間:2018-09-25

相信屏幕前的你,可能被 shRNA 干擾實(shí)驗(yàn)困擾了無(wú)數(shù)個(gè)日日夜夜......
亦或是屢屢想嘗試,卻次次與之失之交臂......
......被困擾的你是跪在哪一步了呢?
......而止步于起點(diǎn)的你又是因?yàn)槭裁茨兀?/p>


今天寫作這篇文章的目的呢,正是為幫助做實(shí)驗(yàn)的你縷清思路。讓在干擾實(shí)驗(yàn)門口「探頭」的你,系統(tǒng)的了解整個(gè)流程,從而讓入門不再只是想象。

下面我要開始放大招了:

(一)shRNA 干擾機(jī)制&shRNA 設(shè)計(jì)

shRNA(short/ small hairpin RNA)干擾機(jī)制圖解



 

shRNA 組成:

shRNA 包括兩個(gè)短的反向互補(bǔ)序列,中間由莖環(huán)(loop)序列分隔,組成發(fā)夾結(jié)構(gòu),隨后連上 5~6 個(gè) T(轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))

手動(dòng)設(shè)計(jì),原則:

A. 首先靶位點(diǎn)選擇應(yīng)該避開基因的非編碼區(qū);

B. 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù) 3 個(gè)或以上的 T,這可能導(dǎo)致 shRNA 轉(zhuǎn)錄的提前終止;

C. Stratagene 發(fā)現(xiàn) 29 個(gè)寡核苷酸抑制目的基因表達(dá)的效率比 23 個(gè)寡核苷酸的高;

D. 在啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè) C,使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生;

E. shRNA 目的序列的個(gè)堿基必須是 G 以確保 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以 G 開頭,必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè) G;

F. shRNA 插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央,比較了眾多不同長(zhǎng)度和序列的莖環(huán),5'TTCAAGAGA3' 序列zui為有效;

G.  5~6 個(gè) T 必須放置在 shRNA 插入片段尾部以確保 RNA 聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄;

shRNA 設(shè)計(jì)好并合成之后,通過同源重組或者是酶切連接的方法進(jìn)行干擾載體構(gòu)建,構(gòu)建成功后大量抽提質(zhì)粒(去內(nèi)毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右),以備轉(zhuǎn)染。

 

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